万历十九年（1591年），朱厚烷病故，应由朱载堉继承郑王的爵位。他经过15年7次上疏，最后获准将爵位让给同族兄弟朱载玺，迁居怀庆府城外，继续从事研究与写作，写出了最后三部著作。
朱载堉是一位杰出的科学巨匠，在数学、物理、天文、历法、音乐、舞蹈、文学诸方面都有相当的造诣和成就。创建十二平均律，则是他最辉煌的科学成果。
十二平均律的创立，解决了近千年来音乐理论上的难题，实现了旋宫转调的愿望，特别是在琴键乐器中，人们可以根据需要自由使用所有的键了。这是朱载堉对世界文化史的杰出贡献。
朱载堉创建十二平均律后，将阐述它的原理和计算方法的著作刊刻成书，进呈明神宗。明神宗未予重视，把这些著作通通“宣付史馆，以备稽考，未及施行”[26]。清代高宗弘历组织人编写的《御制律吕正义后编》，还为十二平均律罗织“十大罪状”，斥之为“臆说”。但是它一传到西方，便引起欧洲音乐界的强烈反响。德国的赫尔姆霍茨赞叹说：“在中国人中，据说有一个王子叫载堉的，他在旧派音乐家的大反对中，倡导七声音阶。把八度分成十二个半音以及复调的方法，也是这个有天才和技巧的国家发明的。”[27]欧洲最早提出十二平均律的数学计算公式的，是荷兰的斯特芬和法国的默森，时间都比朱载堉晚，而真正对欧洲音乐界产生影响的默森公式，则比朱载堉晚了55年。英国的科技史专家李约瑟指出：“朱载堉对人类的贡献是发现了将音阶级调谐为相等音程的数学方法。……第一个使平均律数学上公式化的荣誉确实应当归之中国。”[28]